У микроорганизмов в процессе обмена веществ возникают разнообразные биохимические реакции, продукты которых часто используются в народном хозяйстве. Из всех биохимических процессов, связанных с жизнедеятельностью микроорганизмов, наиболее широко применяется спиртовое брожение. Название процесса — брожение произошло от латинского слова fermenta — ti’o, что означает кипение (бродящие жидкости сильно перемеща­ются вследствие выделяющейся углекислоты). Совершенно не

Зная дрожжей и сущности спиртового брожения, люди с древ^ времен занимались приготовлением опьяняющих напитков.

Работы Пастера внесли ясность в вопросы различных бро^ия ний. Он впервые в 1857 г. установил, что в процессах броже*и_ принимают участие микроорганизмы, что брожение — это би<?ов> мические процессы, связанные с жизнедеятельностью микро^и’ а не химические, как считали Ю. Либих и другие исследоват^,^. Пастер показал, что молочнокислое брожение вызывается ба^ ое риями, а спиртовое — дрожжами. Он доказал, что спирте?^ брожение может происходить и в среде, не содержащей бел^иё а только соли аммония и сахар. По его мнению, превраще^_ сахара в спирт и углекислоту происходит в результате анаэрд0_ ного дыхания дрожжей. Спиртовое брожение является физи<? ых гическим процессом, тесно связанным с жизнью дрожже^е_ клеток. Он установил также (1875 г.), что маслянокислое бро^ит ние, вызываемое соответствующими бактериями, происхо^ез в отсутствии кислорода. Следовательно, жизнь возможна и кислорода. ,ах

В 1858 г. М. Траубе высказал предположение, что в дрожт^ит образуются ферменты, под действием которых и происхс7^е_ процесс брожения. Но все попытки выделить из дрожжей бес!^ть точный сок, содержащий ферменты и способный сбражи0 ат_ сахар на спирт и углекислоту, долгое время были безрезуль^ но ны. Только М. М. Манассеина в 1871 г. впервые эксперимента./!^, установила, что спиртовое брожение может протекать под ствием клеточного сока без участия живых дрожжей. Клеточ> из. •дрожжевой сок она получила путем растирания дрожжей с мельченным горным хрусталем. Свои исследования она onyd^ г ковала в работе «К учению об алкогольном брожении». В 189^ри немецкий ученый Э. Бухнер проводил спиртовое брожение помощи клеточного сока, полученого им из растертых дрож?2им путем прессования под большим давлением (до 500 атм). Та^"не образом было доказано, что процесс брожения вызывается собственно дрожжевыми клетками, а ферментами, содержаще ед_ ся в них. Из дрожжей был получен также препарат зимин, п[?,ра ставляющий собой убитые ацетоном или смесью спирта и эф^го клетки. При помощи этого препарата при наличии актив^ фермента зимазы было осуществлено спиртовое брожение-. ов.

В то время считали, что существуют ферменты двух виА, ие одни представляют собой живые микроорганизмы, получивКце_ название организованных ферментов; другие же являются ве ствами, которые вырабатываются микроорганизмами, их из^ни кают из клеток различными методами, и для своего действия ом не нуждаются в живой клетке. Они были названы Пастег^ие неорганизованными ферментами. Позже они получили назв£ сде энзимы (по-гречески «энзиме» означает «в дрожжах»), Пс^сл открытия дрожжевого сока это деление утратило свой см£* из Наиболее совершенный метод получения клеточного сока

Дрожжей предложил русский биохимик А. Н. Лебедев в 1911 г. Дрожжи, подсушенные в термостате при 25—30°, обрабатывают’ водой в течение 2 часов при температуре 35° и затем отфильтро­вывают. Этот дрожжевой сок получил название мацерационный сок Лебедева (мацерация — обозначает размачивание, выщела­чивание или экстрагирование). Этот сок широко применяется исследователями всего мира для изучения химизма спиртового брожения. В дрожжевом соке были найдены различные фермен­ты, в частности фермент, вызывающий брожение сахарного раст­вора с образованием спирта и выделением углекислоты и полу­чивший название зимазы (по-гречески zyme — дрожжи). Даль­нейшие исследования показали, что зимаза является комплексом ферментов, принимающих участие в спиртовом брожении. Было также обнаружено, что после диализа зимаза инактивируется, причем ее активность может быть восстановлена добавлением диализата, т. е. веществ, удаляемых при диализе. Эти каталити­ческие вещества, в отсутствие которых спиртовое брожение пре­кращается, были названы коферментами. Для брожения необхо­димы как ферменты, так и коферменты. Процесс брожения, вы­зываемый клеточным соком, оказался аналогичен брожению, вызванному живыми дрожжевыми клетками. В настоящее время считается, что дрожжи и другие микроорганизмы действуют на субстраты посредством своих ферментов, которые путем приве­денных на стр. 520 специальных методов могут быть отделены от выработавших их микробных клеток.

Многие исследователи работали над вопросами спиртового брожения. Л. А. Иванов впервые установил в 1903 г. участие фосфорной кислоты в процессах брожения и показал, что стиму­лирующее действие фосфата сводится к тому, что образуется промежуточное соединение фосфорной кислоты (фосфорные эфиры), способное к дальнейшим превращениям. Этот процесс, получивший название фосфорилирования, является промежуточ­ной стадией брожения. Кроме того, в присутствии неорганических соединений фосфора скорость брожения быстро возрастает. В дальнейшем было установлено, что независимо от того, какой гексозный сахар был взят для брожения, в результате фосфори­лирования образуется’ дифосфат фруктозы. Роль фосфора в этих процессах изучали также английские ученые А. Гарден и Т. Юнг (1905). Они разработали схему спиртового брожения, включаю­щую образование фосфорных эфиров. А. И. Лебедев (1881—1938) открыл многие основные этапы спиртового брожения, используя дрожжевой сок, полученный по его методу. Для разделения смеси ферментов А. И. Лебедев применял ультрафильтрацию через желатиновые фильтры. Он совершенно верно определил роль ко­фермента как передатчика водорода при процессах брожения. В настоящее время установлено, что коферменты состоят из ком­плекса различных веществ. В результате своих исследований А. И. Лебедев выработал схему брожения, которая является наи­более близкой к установленному теперь химизму брожения. С. П. Костычев (1877—1931) установил единство и общие черты В спиртовом, молочнокислом и маслянокислом брожениях, а так­же открыл уксусный альдегид как промежуточный продукт спир­тового брожения, восстанавливающийся в этиловый спирт.

Промежуточные продукты брожения и ферменты были выде­лены и исследованы по следующей методике: бесклеточное бро­жение осуществляли при помощи ферментного сока и, применяя специфические яды, останавливали на определенных стадиях; яды парализовали действие отдельных ферментов, оставляя не­тронутыми другие. Из комплекса зимазы выделяли и исследовали коферменты. Добавление ядов (бисульфит натрия, фтористый натрий и соли монойодуксусной кислоты) привело к накоплению продуктов промежуточного обмена, которые были изолированы и идентифицированы. Был применен также принцип улавливания, т. е. химическое связывание промежуточных продуктов брожения. Наконец, для наиболее тонкого изучения деталей химизма ис­пользовали изотопы (радиоактивный фосфор с атомным весом 32), позволяющие распознавать их в составе новообразующихся соединений.

Таким образом, различные исследователи создали схемы хи­мизма спиртового брожения. Многие из этих схем оказались не совсем верными, от некоторых в настоящее время отказались.

Большой вклад в изучение действия ферментов и их природы внесли А. Н. Бах (1857—1946) и В. И. Палладии (1859—1922) ,и другие исследователи. Итак, в настоящее время выяснена при­рода и химизм различных брожений и, в частности, спиртового брожения.

Спиртовым брожением называется процесс превращения сахара, содержащегося в бродящей жид кости, под действием микроорганизмов в спирт и углекислый г а з. При этом проходит следующая реакция:

Со н1206 = 2 с2 н5 — он + 2 с02 + 28 ккал.

Возбудителями спиртового брожения являются различные ви­ды специально культивируемых дрожжевых микроорганизмов. Кроме дрожжей, спиртовое брожение могут вызывать некоторые виды дрожжеподобных грибков, плесневых грибов и бактерий. Из плесневых грибов наибольшей спиртообразующей способ­ностью обладают мукоровые грибы. К ним относятся: 1) амило — мицеты (Amylomycetes), или крахмальные грибки, называемые так благодаря их способности осахаривать крахмал; эти грибки образуют фермент амилазу, которая превращает крахмал, на­пример риса, кукурузы, в декстрины и мальтозу, а имеющийся в этом мукоровом грибке фермент мальтаза расщепляет их в глюкозу; последняя сбраживается мукором или частично дрож­жами в спирт и углекислоту благодаря наличию в них зимазы. Эти процессы проходят лучше при некотором доступе воздуха.

Микроорганизмы, которые получают необходимую для их жизне­деятельности энергию только анаэробным путем, т. е. в результате различных брожений. И во-вторых, хотя при брожении для полу­чения энергии и расходуется большое количество исходного ма­териала, но создаются условия, в которых не развиваются другие микробы, конкурирующие с микроорганизмами, вызывающими брожение. Например, продукт жизнедеятельности дрожжей — этиловый спирт является губительным для многих бактерий и плесеней; продукт жизнедеятельности молочнокислых бакте­рий — молочная кислота оказывает вредное действие на многие бактерии и другие микроорганизмы. Таким образом, анаэробное дыхание для многих микроорганизмов является целесообразным и оправданным жизненным процессом.

В процессе жизнедеятельности некоторые микроорганизмы выделяют тепловую или световую энергию. Выделять в окружаю­щую среду то или иное количество тепла способны почти все ми­кроорганизмы. Тепло выделяется в результате неполного исполь­зования микроорганизмами энергии окисления органических веществ, полученной в результате дыхания. Путем калориметри­ческого анализа установлено, что для своей жизнедеятельности микроорганизмы обычно используют около 50% от общего коли­чества выделяющейся при дыхании энергии, а многие — не более 10—25%. В результате выделения микробами тепла во внешнюю среду сам<?разогреваются некоторые органические материалы — сено, торф, навоз. При этом создаются условия для развития термофильных микроорганизмов, развивающихся при повышен­ных температурах.

Некоторые микроорганизмы выделяют часть энергии во внеш­нюю среду в виде света. Они принадлежат к группе аэробных бактерий. Свечение у них всегда связано с присутствием свобод­ного кислорода, который интенсивно окисляет особые фотоген­ные вещества, находящиеся в теле бактерий. Возможно, в свече­нии бактерий участвуют и особые ферменты. Чаще всего светя­щиеся микробы встречаются в морской воде. Очевидно, для их жизнедеятельности необходимы соли, в частности NaCl. Цвет и интенсивность свечения могут быть различны в зависимости от количества кислорода. Чем его больше, тем ярче свечение.

Спиртовое брожение

У микроорганизмов в процессе обмена веществ возникают разнообразные биохимические реакции, продукты которых часто используются в народном хозяйстве. Из всех биохимических процессов, связанных с жизнедеятельностью микроорганизмов, наиболее широко применяется спиртовое брожение. Название процесса — брожение произошло от латинского слова fermenta — ti’o, что означает кипение (бродящие жидкости сильно перемеща­ются вследствие выделяющейся углекислоты). Совершенно не Зная дрожжей и сущности спиртового брожения, люди с древних времен занимались приготовлением опъяняющих напитков.

Работы Пастера внесли ясность в вопросы различных броже­ний. Он впервые в 1857 г. установил, что в процессах брожения принимают участие микроорганизмы, что брожение — это биохи­мические процессы, связанные с жизнедеятельностью микробов, а не химические, как считали Ю. Либих и другие исследователи. Пастер показал, что молочнокислое брожение вызывается бакте­риями, а спиртовое — дрожжами. Он доказал, что спиртовое брожение может происходить и в среде, не содержащей белков, а только соли аммония и сахар. По его мнению, превращение сахара в спирт и углекислоту происходит в результате анаэроб­ного дыхания дрожжей. Спиртовое брожение является физиоло­гическим процессом, тесно связанным с жизнью дрожжевых клеток. Он установил также (1875 г.), что маслянокислое броже­ние, вызываемое соответствующими бактериями, происходит в отсутствии кислорода. Следовательно, жизнь возможна и без кислорода.

В 1858 г. М. Траубе высказал предположение, что в дрожжах образуются ферменты, под действием которых и происходит процесс брожения. Но все попытки выделить из дрожжей бескле­точный сок, содержащий ферменты и способный сбраживать сахар на спирт и углекислоту, долгое время были безрезультат­ны. Только М. М. Манассеина в 1871 г. впервые экспериментально установила, что спиртовое брожение может протекать под дей­ствием клеточного сока без участия живых дрожжей. Клеточный дрожжевой сок она получила путем растирания дрожжей с из­мельченным горным хрусталем. Свои исследования она опубли­ковала в работе «К учению об алкогольном брожении». В 1897 г. немецкий ученый Э. Бухнер проводил спиртовое брожение при помощи клеточного сока, полученого им из растертых дрожжей путем прессования под большим давлением (до 500 атм). Таким образом было доказано, что процесс брожения вызывается не собственно дрожжевыми клетками, а ферментами, содержащими­ся в них. Из дрожжей был получен также препарат зимин, пред­ставляющий собой убитые ацетоном или смесью спирта и эфира клетки. При помощи этого препарата при наличии активного фермента зимазы было осуществлено спиртовое брожение-.

В то время считали, что существуют ферменты двух видов: одни представляют собой живые микроорганизмы, получившие название организованных ферментов; другие же являются веще­ствами, которые вырабатываются микроорганизмами, их извле­кают из клеток различными методами, и для своего действия они не нуждаются в живой клетке. Они были названы Пастером неорганизованными ферментами. Позже они получили название энзимы (по-гречески «энзиме» означает «в дрожжах»). После открытия дрожжевого сока это деление утратило свой смысл. Наиболее совершенный метод получения клеточного сока из

В бродящей жидкости образуется до 5—6% спирта; крахмальные грибки распространены в различных странах Азии и на островах, где их используют для получения спиртных напитков; 2) яван­ский мукор (Mucor javanicus) также вызывает спиртовое бро­жение и по своему действию сходен с амиломицетами. Другие мукоровые грибки образуют меньшее количество этилового спир­та, достигающее 2—2,5%. Например, в результате действия грибка Mucor racemosus образуется 2,5% спирта. В отличие от многих мукоровых грибков он образует, кроме других фермен­тов, сахаразу и поэтому обладает способностью сбраживать жидкости, содержащие сахарозу. Различные ферменты — амила­зу, сахаразу, инулазу, мелибиазу и зимазу содержит также мукор Rhizopus japonicus, относящийся к роду, ризопов. Эти грибки могут расщеплять крахмал, инулин, сахарозу и вызывать спир­товое брожение. Некоторые мукоровые грибы применяются в про­изводстве для получения спиртных напитков, но большинство из них являются вредителями процесса брожения.

Из других грибков способны вызывать спиртовое брожение некоторые виды монилии, но в отличие от мукоровых грибов брожение, вызываемое этими грибами, не зависит от присутствия кислорода. Недостатком брожений, вызываемых плесневыми гри­бами, является то, что они для своего развития используют боль­шое количество углеводов и на поверхности жидкости образуют воздушный мицелий.

Спиртовое брожение могут вызывать также и некоторые бак­терии, но, кроме этилового спирта, в отбродившей жидкости появляется молочная кислота и ряд других побочных продуктов. Например, бактерия Termobacteri’um mobile сбраживает сусло, содержащее фруктозу, глюкозу, сахарозу, образуя при этом око­ло 45—46% этилового спирта (от потребленного сахара), 45—45,5% углекислоты и 6—7% молочной кислоты. Таким обра­зом, некоторые плесневые грибы и бактерии можно использовать для приготовления слабоалкогольных напитков.

Основными микроорганизмами, вызывающими спиртовое брожение, являются дрожжи. Они находят наиболее широкое применение в народном хозяйстве.

Классификация и систематика дрожжей, В основу система­тики дрожжей положены различия в способах размножения, спо­рообразования, в местах их обитания, в приспособлении к усло­виям существования и физиологические признаки. В настоящее время существуют: 1) система дрожжей Гийермона, охватываю­щая все дрожжи, и 2) система дрожжей В. И. Кудрявцева, вклю­чающая только настоящие, т. е. спорообразующие дрожжи.

По Гийермону, дрожжи делятся на два семейства: I) семей­ство сахаромицетов (Saccharomycetaceae), или настоящих дрож­жей, к которому относятся все одноклеточные дрожжевые грибки, образующие споры, и 2) семейство несахаромицетов (Non Sac­charomycetaceae), объединяющее так называемые ложные дрож­жи, или дрожжеподобные грибки, размножающиеся почкованием, нС не образующие спор. На основании различных признаков семейства делятся на подсемейства, роды, виды.

В. И. Кудрявцев составил естественную систематику дрож­жей, отображающую генеалогическую историю их происхожде­ния, т. е. исторически сложившиеся взаимные связи организмов с условиями жизни и организмов между собой. В. И. Кудрявцев распределяет дрожжи на систематические группы в зависимости от степени общности их специфической приспособленности к ус­ловиям жизни, к месту обитания.

В класс грибов входит порядок одноклеточных немицелиаль — ных дрожжевых организмов, носящий название Uni’cellomyceta — les. В определенных условиях обитания дрожжи представляют собой единичную, неразветвленную и окруженную оболочкой клетку. С мицелиальными грибами их связывает общий источник питания — безазотистые соединения углерода. В зависимости от способа вегетативного размножения, являющегося морфологиче­ским выражением определенной приспособленности дрожжей, они делятся на три семейства: 1) Saccharomycetaceae, к которо­му относятся все почкующиеся дрожжи; 2) Shi’zosaccharomyceta — сеае — объединяет дрожжи, размножающиеся делением; 3) Sac — charomycodaceae; к этому семейству относятся дрожжи, у кото­рых вегетативное размножение начинается с образования почек, а заканчивается отделением почек при помощи перегородок, Т. е. делением.

Семейства делятся на роды в зависимости от способа образо­вания и прорастания спор, их формы, причем эти признаки также связаны с приспособлениями дрожжей. Например, дрожжи рода Saccharomyces, имеющие шаровидные или овальные споры, ха­рактеризуются определенным углеводным обменом — активно сбраживают сахар на спирт.

Роды распадаются на многочисленные виды, приспособившие­ся к тем или иным условиям жизни в природе и в хозяйстве чело­века и поэтому обладающие определенными структурными и фи­зиологическими признаками. Дрожжи рода Saccharomyces включают 18 видов, например вид Saccharomyces vini’, сущест­вующий в условиях бродильных производств. Различные формы существования вида, имеющие какие-либо дополнительные при­способления и отличия, являются его разновидностями (культу­ры, штаммы дрожжей)..

По мнению В. И. Кудрявцева, дрожжевые организмы, не об­разующие споры, но имеющие другие общие свойства с почкую­щимися спорообразующими дрожжами, должны быть отнесены к общему классу грибов Fungi, порядку Unfcellomycetales и се­мейству Saccharomycetaceae, так как способностью к спорообра­зованию не обладал их общий предковый вид. Это свойство воз­никло у некоторых из дрожжевых организмов в процессе эволю­ции и приспособления к неблагоприятным условиям существова­Ния. Другие же организмы, не образующие споры, выработали иные средства защиты. Эта систематика дрожжей является наи­более правильной.

Для определения принадлежности дрожжей к тому или иному виду используют методы, изложенные на стр. 499. Основным методом является выращивание их на разных специальных сре­дах. Например, чистые культуры дрожжей выращивают: 1) на дрожжевой воде с двухпроцентными растворами различных Са­Харов— глюкозой, галактозой, сахарозой, лактозой и др.; 2) на синтетических средах с различными источниками азотистого питания — пептоном, сернокислым аммонием, нитратами; 3) на других твердых средах.

На основании определения характера роста, величины и формы дрожжевых клеток, отдельных колоний и штриха определяют вид дрожжей. Учитывается также спиртообразующая способность и активность накопления биомассы у дрожжеподобных грибков.

Дрожжи можно применять только тогда, когда их свойства соответствуют требованиям того или иного производства. Кроме того, среди дрожжей имеются и такие, которые вызывают явле­ния, отрицательно влияющие на данное производство.