• Аркадий П.Синицын
• Хим факультет МГУ им.М.В.Ломоносова
• Институт биохимии
• им.А.Н.Баха РАН

Виды возобновляемого сырья

• Сахароза, меласса (из сладкого тростника и сладкой свеклы)
• Отходы пищевой индустрии (переработки яблок, цитрусовых, сои, молока, и т.д.)
• Крахмалосодержащее сырье (зерно, картофель)
• Топинамбур (полифруктан)
• Растительная биомасса
• Древесная порода и отходы ее переработки
• Одногодичные растения, трава, травка, водные растения, и т.п.
• Целлюлозосодержащие отходы индустрии и сельского хозяйства

Получение спиртов из отходов пищевой индустрии

Получение спиртов из отходов пищевой индустрии

Получение спиртов из топинамбура

Получение спиртов из крахмалистого сырья

Получение спиртов из целлюлозосодержащего сырья (раздельные гидролиз и сбраживание)

Получение спиртов из целлюлозосодержащего сырья (одновременный гидролиз и сбраживание)

Ферментативный гидролиз целлюлозы

Сопоставление эффективности разных способов предобработки лигноцеллюлозного сырья 10 FPU / 1 г субстрата + 20 bGU / г, [S] = 100 г/л, pH 5, 50?C, 24 h

• Багасса / паровой взрыв
• Пшеничная трава / паровой взрыв
• Овсяная шелуха / паровой взрыв
• Рисовая шелуха / паровой взрыв
• Хвойная древесная порода / сухое измельчение
• Лиственная древесная порода / паровой взрыв
• Лиственная древесная порода / органозольв
• Целлюлоза (ЦБК)

ПРЕДОБРАБОТКА

• Предобработка лигноцеллюлозного сырья играет важную роль для роста его обскурантистской возможности
• Способ сухого измельчения значительно наращивает обскурантистскую способность лигноцеллюлозного сырья

Наличие ферментов, штаммов-продуцентов, систем экспрессии генов (грибы)

• Штаммы супер-продуценты ферментов:
• Разные штаммы Trichoderma sp.
• Разные штаммы Penicillium sp.
• Разные штаммы Aspergillus sp.
• Ферменты:
• Целлюлазы (CBH1, CBH2, Eg1, Eg2, Eg3, и др.)
• ?-глюкозидазы (целлобиазы, экзо-?1,4/1,3-глюкозидаза)
• Гемицеллюлазы (эндо-ксиланазы, эндо-маннанзы,
• ?-ксилозидазы, арабиназы, ?-галактозидазы,
• ?-галактозидазы, и др.)
• Пектиназы (пектин-лиазы, полигалактуроназы)
• Амилазы (?-амилаза, глюкоамилаза, и др.)
• Инулиназы (эндо-инулиназа, экзо-инулиназа)
• Системы экспрессии генов:
• Penicillium 537
• Penicillium PCA
• Aspergillus sp.

(I) Стратегия сотворения штаммов-продуцентов

• Селекция продуцента уникальных ферментов посреди одичавших штаммов микробов, получение супер-продуцента при помощи мутагенеза и селекции, оптимизация процесса ферментации
• Трудности – огромные издержки времени, невозможность предсказать состав комплекса секретируемых ферментов

Выбор продуцента уникального целлюлазного комплекса. Гидролиз пихты, обработанной паровым взрывом различными целлюлазами 10 FPU / 1 г субстрата, [S] = 5%, рН 5, 50оС

Сделаны промышленные штаммы -суперпродуценты целлюлаз и сопутствующих ферментов

• Целлюлазы Penicillium владеют уникально высочайшей осахаривающей способностью по сопоставлению с Trichoderma
• Значительно, что конкретно на целлюлазы Trichoderma делают ставку ведущие мировые биотехнологические компании

Целлюлазы Penicillium и Trichoderma

• Ферменты Penicillium владеют более высочайшей осахаривающей активностью, ферменты Trichoderma
• Вероятные предпосылки:
• Более высочайшая удельная активность личных ферментов
• Большая разнообразность целлюлазного комплекса
• Наличие ?-глюкозидазы (целлобиазы)
• Наименьшая степень ингибирования лигнином

Генно-инженерный подход

Способы получения рекомбинантных штаммов

• Получение штамма реципиента (ауксотрофный мутант, маркерный ген)
• Выделение мотивированного гена (гомологичного, гетерологичного)
• Включение мотивированного гена в экспрессионную кассету (создание вектора)
• (Ко)трансформация протопластов реципиентного штамма
• Регенерация протопластов, первичный скрининг трансформантов на мотивированную активность (качалочные пробирки, планшеты)
• Вторичный скрининг трансформантов (1-л, 3-л ферментеры), получение, тесты и исследование параметров ферментных препаратов, выделение и исследование параметров гомогенных мотивированных ферментов
• Получение ш
  тамма продуцента

(II) Стратегия сотворения штаммов продуцентов

• Создание рекомбинантных штаммов – продуцентов личных (мотивированных) моно-ферментных препаратов
• Неувязка – моно-ферментные препараты
• не могут выполнить действенное осахаривание разных видов растительного сырья

Создание рекомбинантных штаммов – продуцентов личных (мотивированных) ферментов (II)

Создание рекомбинантных штаммов – продуцентов личных (мотивированных) моно-ферментных препаратов (II)

Раздельная ферментация рекомбинантных штаммов Penicillium 537 – продуцентов различных мотивированных ферментов (II)

Одновременная ферментация разных рекомбинантных штаммов Penicillium 537 – продуцентов личных ферментов (II)

(III) Стратегия сотворения штаммов – продуцентов

• Создание штаммов – продуцентов мультиферментного комплекса с увеличенной активностью определенного (мотивированного) фермента
• Неувязка – продуктивность по своим ферментам мультиферментного комплекса может уменьшиться

Создание рекомбинантных штаммов – продуцентов мультиферментного комплекса с увеличенной активностью определенного (мотивированного) фермента (III)

(IV) Стратегия сотворения штаммов — продуцентов

• Создание штаммов – продуцентов консистенции заблаговременно избранных (мотивированных) ферментов
• Неувязка – необходимость иметь в наличии широкий круг очищенных ферментов для подготовительных тестов по выбору более активных осахаривающих ферментов
• Могут появиться препядствия при экспрессии консистенции мотивированных ферментов в подходящей пропорции

Опыты по выбору более активных осахаривающих ферментов (IV) Предобработанные кукурузные початки, pH5, 50?С, 72 часа Доза по белку – 0.2 мг/мл, целлобиаза – 0.1 ед/мл

Создание рекомбинантных штаммов — продуцентов консистенции заблаговременно избранных (мотивированных) ферментов (IV)

Авторский коллектив:

Спасибо за внимание!

• +7 (495) 939-5966
• apsinitsyn@gmail.com
• www.enzyme.chem.msu.ru/cellulas/